mRNA学院上线:解密生产工艺四大挑战

新型冠状病毒mRNA疫苗的高保护性,有力推动了mRNA技术的商业化进程。Moderna,BioNTech,Genentech,艾博生物等国内外企业纷纷布局,数十个项目进入临床阶段。除了已经获批的新冠疫苗,mRNA技术还广泛应用于肿瘤疫苗、免疫调节药物、CAR-T和抗体药物。但作为新兴的生物制药技术,mRNA制备及生产工艺依旧面临诸多挑战和技术瓶颈。

mRNA药物制备工艺有多个环节,其中包含四个关键步骤:环状质粒生产与线性化(linearization)、体外转录(In Vitro Tranion, IVT)与纯化、LNP(lipid nanoparticles)设计生产、制剂灌装等,每个步骤均存在不同的工艺难点。

化学合成mRNA,通常长度限于100核苷酸内,无法满足药物设计需求,因而目前mRNA药物以质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)为模板,使用酶法进行体外转录。

pDNA生产是mRNA药物的第一步,通常采用i发酵,过程包括工程菌种子库的建立和检定,菌种复苏,发酵培养、收获澄清、层析纯化、线性化、分装储存等步骤。

目前mRNA体外转录广泛使用T7 RNA聚合酶,该酶具有读通质粒DNA终止信号的能力,如果是环形的质粒DNA,则容易转录所需目标序列下游的序列,产生长度不一的产物,所以通常需要使用限制性内切酶线性化环状pDNA。线性化过程会带来新的工艺挑战,比如线性化条件(质粒浓度,酶浓度,温度,孵育时间等)优化、线性化程度检测、纯化工艺优化、酶切相关工艺杂质(不完全酶切产物,酶残留等)表征等,另外工艺环节多,每一步都会降低质粒DNA回收率,目前回收率大约在30-40%。如何增加回收率也是降低成本,增加生产效率的关键。

mRNA原液制备包括IVT、化学修饰、分离纯化、mRNA原液分装冻存等多个步骤,其中IVT是核心。

一般来说,IVT反应需要惰性和非吸附反应管,反应体系中包含DNA模板、转录缓冲液、NTPs、RNase抑制剂和RNA聚合酶等。工艺主要挑战是即使采用同样的试剂和耗材,也存在转录效率的不同。

此外,IVT产物是一个混合物,不仅含有所需的目标mRNA产物,还含有一些杂质,包括酶、残留的NTPs和DNA模板,以及IVT过程中形成的异常mRNA产物。实验室级纯化方法是基于DNAse消化去除DNA,然后采用氯化锂沉淀。但是这些方法不能去除一些罕见的mRNA产物,如dsRNA和截断的RNA片段。但这些产品相关的杂质会降低翻译效率,并具有免疫原性,因而开发完备高效的工业级分离纯化工艺,及产品相关杂质表征方法建立也是工艺挑战之一。

体内广泛存在mRNA酶,是制约mRNA药物应用于人体的主要障碍。近年来,mRNA递送技术产生了飞快的发展,其中脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNP)研究最为广泛,也是目前临床使用药物的主要递送载体。LNP是一种有机的、不溶于水的脂质化合物,具有亲水的头部和疏水的尾巴,自组装成膜结构。血清中的载脂蛋白E(ApoE)可与静脉注射的LNPs结合,肝脏是清除ApoE结合脂蛋白的主要器官;因此,系统递送的LNPs-RNA将结合ApoE,优先进入肝脏。过度的肝脏归巢是静脉注射可电离LNPs的一个显著缺点,目前多家企业在开发选择性器官靶向(selective organ targeting,SORT)LNP,以应对这一挑战。

现在的研究显示人体可对LNP成分(如PEG)产生免疫反应,引起炎症副作用,比如心包炎、心肌炎、神经系统炎症等。如何优化LNP设计,降低mRNA疫苗炎症副作用是目前依旧没有解决的挑战。

目前,mRNA疫苗制剂主要有两个挑战,一是LNP容易聚集、泄漏或融合,二是封装的mRNA容易降解等。前者可以通过将稳定脂质和聚乙二醇加入纳米颗粒来轻松解决,而后者则相对难以处理,也是产品在非冷冻短期存储中不稳定的主要因素。所以目前上市的mRNA疫苗储存及运输条件苛刻。以新冠疫苗为例,Moderna的冠状病毒疫苗要求的储存温度为-20°C;辉瑞疫苗在-70℃超低温冷冻箱中,可以保存六个月,而在2-8°C冰箱中,只能保存5天。严苛的条件会增加运输成本,温度稳定性差,会增加终端使用效果的差异。

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